CNRS - AIX MARSEILLE UNIV : UMR7257

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Titration Calorimétrique Isotherme

iTC200, Microcal (GE Healthcare)

Responsable Maria MATE

Introduction

La calorimétrie isotherme à titrage ( CIT, ou en anglais ITC pour "Isothermal Titration Calorimetry" ) est une puissante technique analytique qui permet de mesurer l’affinité et d’autres paramètres thermodynamiques concernant la liaison de deux molécules. Avec un calorimètre ITC on peut mesurer directement et de façon précise la chaleur produite ou absorbée par l’interaction des molécules. La mesure de cette chaleur rend possible la détermination directe, en une expérience, de la constante d’affinité à l’équilibre (KD), la stœchiométrie de la liaison (n) et l’enthalpie (ΔH) de la réaction. Avec le premier et le dernier de ces paramètres on peut aussi dériver l’entropie (ΔS) de la réaction.

Cette technologie a donc un large éventail d’applications, notamment dans la caractérisation des interactions moléculaires entre petites molécules, protéines, anticorps, acides nucléiques, ions métalliques, etc. L’ITC est aussi utile pour l’étude de la cinétique enzymatique ou des phénomènes d’inhibition/compétition. Elle ne requiert pas de marquage ni d’immobilisation et elle est compatible avec la plupart des solutions utilisées en biochimie.

Nous utilisons un calorimètre iTC200 system fabriqué par Microcal (GE Healthcare), qui est l’un des calorimètres de ce type les plus sensibles. La cellule de la sonde fait seulement 200 µL. Il peut mesurer directement des constantes d’association de l’ordre sub-millimolaire à nanomolaire (10-6 to 10-9 M-1). La mesure de constants d’association plus fortes, nanomolaire à picomolaire (10-9 to 10-12 M-1) est envisageable avec la méthode dite "d’association compétitive".

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Informations pratiques

- Quels volumes d’échantillon et de ligand ?

Vous aurez besoin de 300 μl d’échantillon pour la cellule de mesure et de 60 μl de ligand pour la seringue. Pour le bon déroulement de votre expérience l’échantillon et le ligand doivent être strictement dans le même tampon. Idéalement, il faudrait dialyser les deux contre le même tampon et garder un peu de ce tampon pour faire d’autres dilutions s’il s’avère nécessaire. Dans le cas des petits ligands, ils devraient être préparés avec le tampon contre lequel vous avez dialysé la protéine.

C’est important de faire une expérience de contrôle : un titrage du ligand dans la cellule remplie avec le tampon de la protéine. Cela permet de calculer la chaleur de dilution que on pourra en suite soustraire de nos données.

- A quelle concentration ?

L’estimation de la concentration dans la cellule se fait à partir de la valeur dite c :

c = {[cellule] \times n \over {K_D}}

Pour une bonne détermination du Kd, la valeur de c doit être entre 5 et 500 (acceptable, mais pas optimale, entre 1 et 1000). La concentration dans la seringue doit être suffisamment élevée pour assurer qu’à la fin de l’expérience la protéine dans la cellule sera saturée par le ligand.

Recommandation pour un premier essai :

[cellule] = 10 \times K_D
[seringue] = (100 - 150) \times  K_D \times n

Si vous ne connaissez pas le KD, assumez qu’il est 1 μM et faites une première mesure avec 10 μM dans la cellule et 100 μM dans la seringue.

Pour la correcte détermination des paramètres thermodynamiques il faut absolument que les échantillons utilisés soient purs et que la concentration soit estimée avec précision.

- A quelle température travailler ?

La chaleur et la enthalpie d’interaction (ΔH) dépendent de la température. A une certaine température la chaleur d’interaction est zéro, si par hasard on travaille à cette température, le signal mesuré sera près du bruit de fond et l’isotherme d’interaction ne sera pas bien définie. En conclusion, la température est un paramètre à explorer au cours des expériences. Ainsi, le calcul de la ΔH à differentes temperatures permet de calculer la variation de la capacité thermique (ΔCp)

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