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Clonage, expression dans la bactérie, purification de protéines recombinantes

Responsables Renaud VINCENTELLI

Introduction

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La production de protéine à l’AFMB : schéma général

La plateforme de clonage, d’expression et de purification de l’AFMB a le label RIO/IBiSA depuis 2003 et est prestataire de service depuis pour toutes les étapes nécessaires du clonage à la protéine pure.
La plateforme de production de protéine est en lien direct avec les plateformes de caractérisation et de cristallisation de l’AFMB.

Références

  • Vincentelli R, Bignon C, Gruez A, Canaan S, Sulzenbacher G, Tegoni M, Campanacci V, Cambillau C (2003) Acc Chem Res 36 165-172
  • Sulzenbacher G, Gruez A, Roig-Zamboni V, Spinelli S, Valencia C, Pagot F, Vincentelli R, Bignon C, Salomoni A, Grisel S, Maurin D, Huyghe C, Johansson K, Grassick A, Roussel A, Bourne Y, Perrier S, Miallau L, Cantau P, Blanc E, Genevois M, Grossi A, Zenatti A, Campanacci V, Cambillau C (2002) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58 2109-2115

La plateforme de clonage, d’expression et de purification de l’AFMB utilise des stratégies et des méthodes originales à haut débit développés et validés au laboratoire pour les nombreux projets de Génomique Structurale (ASG, X-TB, SPINE, SPINE II, EMEP, VIZIER, VENOMICS (www.venomics.eu)...) dans laquelle le labo est impliqué depuis 2001. Elle est dotée de nombreux équipements, et est toujours en constant développement. Depuis son ouverture nous avons travaillés sur plusieurs milliers de protéines pour nos clients et collaborateurs.

Références

  • Vincentelli R, Cimino A, Geerlof A, Kubo A, Satou Y, Cambillau C (2011) Methods 55 65-72
  • Graslund S, Nordlund P, Weigelt J, Hallberg BM, Bray J, Gileadi O, Knapp S, Oppermann U, Arrowsmith C, Hui R, Ming J, dhe-Paganon S, Park HW, Savchenko A, Yee A, Edwards A, Vincentelli R, Cambillau C, Kim R, Kim SH, Rao Z, Shi Y, Terwilliger TC, Kim CY, Hung LW, Waldo GS, Peleg Y, Albeck S, Unger T, Dym O, Prilusky J, Sussman JL, Stevens RC, Lesley SA, Wilson IA, Joachimiak A, Collart F, Dementieva I, Donnelly MI, Eschenfeldt WH, Kim Y, Stols L, Wu R, Zhou M, Burley SK, Emtage JS, Sauder JM, Thompson D, Bain K, Luz J, Gheyi T, Zhang F, Atwell S, Almo SC, Bonanno JB, Fiser A, Swaminathan S, Studier FW, Chance MR, Sali A, Acton TB, Xiao R, Zhao L, Ma LC, Hunt JF, Tong L, Cunningham K, Inouye M, Anderson S, Janjua H, Shastry R, Ho CK, Wang D, Wang H, Jiang M, Montelione GT, Stuart DI, Owens RJ, Daenke S, Schutz A, Heinemann U, Yokoyama S, Bussow K, Gunsalus KC (2008) Nat Methods 5 135-46

Suite : Stratégie générale

Stratégie

Stratégie générale

Après le clonage dans un ou plusieurs vecteurs d’expressions, nous optimisons le niveau d’expression et de solubilité des protéines à l’échelle analytique en criblant l’influence de parametres tels que les conditions de cultures, l’utilisation de protéines de fusion sur la solubilité… Une fois que nous avons identifiées les conditions qui permettent une production de la protéine soluble nous réalisons une culture de plusieurs litres pour produire la quantité de protéine demandée.

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Figure 2 : La production de protéine à l’AFMB : optimisation de la solubilité des protéines par criblage automatisé

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Clonage

Nous réalisons principalement de l’expression de protéine recombinante dans E. Coli. Nous utilisons géneralement la technologie Gateway (Life Tech ) en format 96 mais d’autres systèmes de clonages sont possibles. L’ADN de départ est soit fourni par le client soit un gene synthétique.
Les clones sont controlés (séquençage) et envoyés au client.

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Figure 3 : Clonage par la technologie Gateway (Life Tech)

Selon les applications, nous possedons une dizaine de vecteurs d’expressions pour E .Coli.

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Expression

Criblage d’expression et de solubilité

Nous avons démontré avec d’autres l’impact des conditions de cultures et de la construction plasmidique sur le niveau d’expression et de solubilité des protéines. Pour pouvoir cribler rapidement le niveau de solubilité, nous avons developpé un protocole propriétaire de criblage à haut débit basé sur un dotblot automatisé qui nous permet de travailler sur un maximum de 1152 cultures/semaine à partir de cultures de 1 ml en deep well 96.

References

  • Berrow NS, Bussow K, Coutard B, Diprose J, Ekberg M, Folkers GE, Levy N, Lieu V, Owens RJ, Peleg Y, Pinaglia C, Quevillon-Cheruel S, Salim L, Scheich C, Vincentelli R, Busso D (2006) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62 1218-26
  • Vincentelli R, Canaan S, Offant J, Cambillau C, Bignon C (2005) Anal Biochem 346 77-84
  • Vincentelli R, Coutard B, Cambillau C (2006). Trends in drug discoveries, 2, 16-18.
  • Vincentelli R, Cambillau C (2005). Tecan Journal, 2, 20-21
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Le criblage automatisé (Crédit : Perrin, CNRS)

Nous possédons deux robots TECAN Evo 200, dont un avec une tête 96. Ces robots sont utilisés pour les clonages, les purifications analytiques, les tests de renaturations, les tests d’activités ou tout autre tests mis au point par l’équipe pour les demandes extérieures.

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Detection du niveau d’expression et de solubilité de protéines par dotblot automatisé sur 1152 cultures simultanées.

Depuis 2010 pour la plupart des applications le dotblot a été remplacé par une détection en microfluidique sur un appareil Caliper GX II (Perkin Elmer) permettant d’obtenir la concentration, la pureté et la masse moléculaire en format 96/384 à une sensibilité et à un débit proche de ceux du dotblot.

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Detection du niveau d’expression et de solubilité de protéines par Electrophorèse Capillaire en format 96/384

L’analyse systématique du niveau de l’expression soluble de dizaine de milliers de cultures ou nous avions criblé l’influence de differentes conditions de culture et de differentes protéines de fusion sur la solubilité des protéines étudiées nous a permis de simplifier notre protocole pour proposer un protocole plus efficace et offrant de meilleurs rendements. Nous commençons toujours par ce protocole et nous criblons les conditions de cultures et les fusions dans un ordre prédefini uniquement dans les cas ou ce protocole unique n’est pas assez performant.

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Protocole de criblage d’expression simplifié

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Renaturation

Renaturation de corps d’inclusions

Dans le cas où seul de l’expression sous forme insoluble est détectée nous faisons un criblage de renaturation graçe au kit developpé au laboratoire et produisons si possible la protéine sous forme native. Nous pouvons produire aussi la protéine sous forme dénaturée (pour produire des anticorps par exemple).

References

  • Vincentelli R, Canaan S, Campanacci V, Valencia C, Maurin D, Frassinetti F, Scappucini-Calvo L, Cambillau C, Bignon C (2004) Protein Sci 13 2782-2792
  • Vincentelli R (2007) in Expression Systems (Michael Dyson and Yves Durocher Eds), Scion publishing.

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Purification

Après une production des protéines en milieu riche nous purifions sur colonne d’affinité (principalement sur colonne Nickel et/ou Strep tag) sur un appareil AKTA Xpress 4 modules. Une étape de purification sur gel filtration est aussi systématiquement faite pour vérifier l’état d’oligomeriation des protéines.

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Système de purification AKTA Xpress (GE Healthcare) Crédit Perrin, CNRS)

Les protéines peuvent ensuite être caractérisées grace à la plateforme de caractérisation ou partir sur la plateforme de cristallogénèse.

Mise en place de nouveaux tests fonctionnels ou d’interactions en format 96 ou 384

En fonction des besoins de nos clients nous pouvons developper à façon tout types de tests robotiques. Certains de ces tests sont ensuite mis à la disposition de la communauté et enrichissent le portfolio des services de la plateforme. Nous avons par exemple developpé deux tests in vitro ; un test d’interaction protéine-ADN (HTP SELEX en format 96) et un test d’intéraction protéine-protéine (HTP Pull-Down et HTP Hold-up en format 96/384). Ces protocoles seront disponibles une fois publiés.

Contact : R. Vincentelli (renaud.vincentelli afmb.univ-mrs.fr)

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