CNRS - AIX MARSEILLE UNIV : UMR7257

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Projets de l’Equipe Longhi

Désordre structural et partenariat moléculaire des régions intrinsèquement désordonnées de la nucléoprotéine et de la phosphoprotéine des Henipavirus

Responsables Sonia LONGHI

Personnes impliquées : J. Habchi (Doctorant), D. Bloquel (Doctorant), A. Gruet (AI, CDD, Etudiant EPHE)

Les virus Nipah et Hendra sont des pathogènes humains majeurs qui ont fait leur apparition récemment. L’organisation unique de leur génome et leur large gamme d’hôtes ont conduit à leur classification dans le genre Henipavirus qui représente le seul genre zoonotic dans la famille Paramyxoviridae. Chez l’homme, ils sont responsables d’encephalites avec un taux de mortalité très élevé. Leur haute virulence et leur large gamme d’hôtes sont à l’origine de leur classification en tant que pathogènes de classe 4. A ce jour, il n’y a aucun traitement thérapeutique efficace contre les virus Nipah et Hendra, ni aucun vaccin. L’interaction N-P étant crucial pour la réplication des Henipaviruses, elle représente une cible potentielle pour la découverte d’antiviraux efficaces. De ce fait, la caractérisation moléculaire des protéines N et P des Henipavirus est un pré-requis pour la conception rationnelle de médicaments contre ces virus.

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Figure 6
Modèles structuraux des complexes NTAIL-PXD du NiV et HeV. La région de NTAIL prédite comme adoptant une conformation α-helicale (acides aminés 473-493 pour NiV et 473-492 pour HeV) est montrée en bleu (représentation en ruban), tandis que PXD est montré en orange (représentation en surface). Les résidus hydrophobes sont montrés en jaune. Le même code couleur est utilisé pour les séquences. Superposition des modèles structuraux (représentation en ruban) des complexes NTAIL-PXD du HeV (rose) et du NiV (orange) sur la structure cristalline du complexe NTAIL-PXD du MeV (bleu) (PDB le code 1T6O)[3]. Modifié à partir de [2].

En utilisant des approches bioinformatiques et expérimentales nous avons montré que les protéines N et P des Henipavirus possèdent des régions intrinsèquement désordonnées de taille importante. En combinant plusieurs méthodes de prédiction de désordre, nous avons montré que le domaine N-terminal de P (PNT) et le domaine C-terminal de N (NTAIL) sont majoritairement désordonnés, bien qu’ils contiennent de courts segments ayant des propensions au repliement. En effet, en utilisant des approches de bioinformatique, nous avons identifié au sein de NTAIL quatre éléments de reconnaissance moléculaires putatifs (MoREs) ayant des propensions structurelles différentes. Nous avons cloné, exprimé et purifié les domaines PNT et NTAIL des Henipavirus. En combinant différentes approches biochimiques et biophysiques, comme la gel filtration, la diffusion dynamique de la lumière, le dichroïsme circulaire et la résonance magnétique nucléaire, nous avons montré que NTAIL et PNT possèdent une certaine structure et compacité résiduelle typique de la sous-famille des premolten globules dans la classe des protéines intrinsèquement désordonnées [1]. De manière notable, nous avons montré que les domaines NTAIL des Henipavirus sont également désordonnés dans le contexte de nucléoprotéines entières [2]. Après avoir purifié les domaines X des phosphoprotéines des Henipavirus (PXD), nous avons montré que NTAIL et PXD forment un complexe ayant une stoichiometrie de 1:1, qui est stable dans des concentrations de NaCl aussi élevées que 1 M, et dont le KD est dans la gamme du µM. En utilisant le dichroïsme circulaire dans l’UV lointain et la résonance magnétique nucléaire, nous avons montré que PXD induit un repliement α-hélical au sein de NTAIL. Les études de spectroscopie de fluorescence montrent l’absence d’impact de PXD sur l’environnement chimique d’un résidu trp introduit au sein de NTAIL (position 527 de N), ce qui suggère l’absence de contacts entre le C-terminus de NTAIL et PXD. En utilisant le complexe NTAIL-PXD du MeV ( [3] comme template, nous avons proposé un modèle structural de l’interaction entre NTAIL et PXD où un court segment de NTAIL ayant une propension au repliement (MoRE, aa 473-493) adopte une conformation α-hélicale en se positionnant entre l’hélice α2 et α3 de PXD, en conduisant à une interface relativement petite dominée par des contacts hydrophobes (Figure 6) [2].
Successivement, pour chaque protéine NTAIL, nous avons conçu quatre constructions tronquées portant des combinaisons différentes des quatre MoREs prédits. Après purification des protéines tronquées à partir de la fraction soluble d’E. coli, nous les avons caractérisés en termes de leurs propriétés conformationnelles, spectroscopiques et de liaison. Ces études ont fourni la preuve expérimentale directe de l’état structural des quatre MoREs et ont montré que deux d’entre eux ont une claire propension α-hélicale, avec celui allant de l’acide aminé 473 à l’acide aminé 493 étant strictement nécessaire pour l’interaction avec PXD. Nous avons aussi montré que les domaines NTAIL et PXD des Henipavirus forment des complexes hétérologues, indiquant que les régions de liaison à PXD sont fonctionellement interchangeables entre les deux virus. Pour finir, au cours de ces études, nous avons montré que le contenu en structure secondaire régulière n’est pas un déterminant majeur de la compaction des protéines [4].
Ces études représentent la première caractérisation expérimentale détaillée de l’interaction N-P chez les Henipavirus. Ils désignent aussi l’interaction NTAIL-PXD en tant que cible très intéressante pour des approches antivirales rationnelles. En collaboration avec K. Alvarez et JC. Guillemot (AFMB), nous sommes actuellement en train de cribler des bibliothèques chimiques (voir http://www.afmb.univ-mrs.fr/-Marsei...) afin d’identifier de composés capables de bloquer l’interaction NTAIL-PXD.

Notes


[1] Habchi J, Mamelli L, Darbon H, Longhi S (2010) PLoS One 5 e11684

[2] Habchi J, Blangy S, Mamelli L, Ringkjobing Jensen M, Blackledge M, Darbon H, Oglesbee M, Shu Y, Longhi S. (2011) J Biol Chem 286 13583-13602

[3] Kingston RL, Hamel DJ, Gay LS, Dahlquist FW, Matthews BW (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101 8301-6

[4] Blocquel D, Habchi J, Gruet A, Blangy S and Longhi S (2012) Mol Biosyst 8 392-410
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