CNRS - AIX MARSEILLE UNIV : UMR7257

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Projets de l’Equipe Lescar

La ribonucléoprotéine de virus de la fièvre de la Vallée du Rift

Personnes impliquées : Dr Julien Lescar, Dr François Ferron, Joelle Boretto

Bunyaviridae est une famille de virus à ARN à brin négatif. Ces virus sont responsables de fièvres hémorragiques, avec un taux de mortalité élevé, pour lesquelles aucun médicament antiviral efficace n’est disponible. Bien que généralement rencontrés chez les arthropodes ou les rongeurs, certains virus qui appartiennent à cette famille peuvent infecter les humains. Cette famille rassemble plus de 250 virus et englobe les Orthobunyavirus, hantavirus, Nairovirus, tospovirus et Phlebovirus. Les Phlebovirus comprennent le virus de la vallée du Rift (RVFV), Toscana virus (TOSV), le virus de la fièvre sicilienne, Punta Toro virus (PTV), et Uukuniemi virus (UUKV). RVFV provoque une maladie endémique à l’Afrique subsaharienne. Les épidémies transmises par les moustiques ont entraîné des pertes économiques massives dues à la mort de nombreux ovins et bovins, en causant des fièvres hémorragiques, l’encéphalite, la vascularite rétinienne, et des maladies chez les humains. Depuis les années 1970, plusieurs grandes épidémies de fièvre de la Vallée du Rift ont eu lieu en dehors de l’Afrique subsaharienne, par exemple, en Egypte, à Madagascar, en Arabie saoudite et au Yémen.

RVFV possède un génome segmenté composé de trois brins d’ARN nommés L, M, S. Le segment L code pour l’ARN-polymérase ARN dépendante, nécessaire pour la réplication virale et la synthèse d’ARNm. Le segment M code pour les glycoprotéines virales, qui font saillie à la surface du virus et pour aider le virus à s’attacher à la cellule hôte. Le segment S code pour la nucléoprotéine (N). N protège les ARN et forme avec la polymérase le complexe ribonucléoprotéine (RNP). N est le principal composant de ce complexe.
N est une protéine de 27 kDa. Au début du projet, on ne connaissait que peu de choses sur la structure de cette protéine et son mode d’assemblage. En effetm différentes stratégies pour assembler N sont utilisées par divers Bunyaviridae. Chez les hantavirus, N a la capacité de pré-former des complexes trimères à travers un domaine en super-hélice précédentes encapsidation de l’ARN. Chez les Phlebovirus (virus Toscana, virus de la fièvre de la Rift Valley), N forme des dimères, tandis que pour Orthobunyavirus N semble rester sous forme de monomère.

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Le travail effectué par François Ferron [1] a été de caractériser la protéine N des Bunyaviridae (en commençant par RVFV) en utilisant à la fois la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique (EM), afin de comprendre les mécanismes d’auto-assemblage et de caractériser les mécanismes de l’encapsidation d’ARN.

Nous avons réussi à cloner, exprimer et purifier N dans des quantités adaptées pour la cristallographie. Nous avons déjà obtenu des cristaux qui diffractent jusqu’à 2 Å qui appartiennent au groupe spatial P6 et avec des dimensions de maille : a = b = 175,24 Å, c = 47,32 Å. On a résolu la structure en utilisant des cristaux de la protéine séléniée.

Grâce à une collaboration avec le groupe du Dr Thomas Walz à la Harvard Medical School, nous avons également utilisé la cryo-microscopie électronique pour caractériser la structure de la ribonucléoprotéine.

L’analyse des échantillons montre que la nucléoprotéine forme plusieurs ensembles : pentamères à octamères comportant une majorité d’anneaux hexamériques. Nous avons effectué la reconstruction par préparation des échantillons et en coloration négative. Nous avons obtenu la reconstruction du complexe pentamérique à une résolution de 20 Å. Nous avons pu placer la structure cristalline aux rayons X dans la reconstruction de cryo-EM

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Nous avons résolu la structure cristallographique de N à partir de RVFV [2], la principale composante du complexe ribonucléoprotéine à 1,6 Å de résolution. Les résultats révèlent deux hélices N-terminales contribuées par un autre monomère. Des anneaux hexamériques environ 45 Å d’épaisseur et avec un diamètre extérieur de 100 Å sont formés par l’intermédiaire d’échanges de bras N-terminaux les plus proches. De même, en utilisant des protéines recombinantes N exprimées chez E. coli et purifiée également dans des conditions natives, la microscopie montre des anneaux dans lequel l’hexamère cristallographique peuvent être placés. Le sillon de liaison à l’ARN et les objectifs du site de multimérisation forment des cibles potentielles pour le développement de médicaments antiviraux. Nous avons l’intention de poursuivre ce travail par la caractérisation des interactions entre N l’ARN à la fois fonctionnelle et en utilisant des méthodes de cristallographie aux rayons X. En collaboration avec la plateforme de criblage AD2P (JC Guillemot), nous prévoyons également de cribler des composés capables d’interférer avec la multimérisation de la protéine N ou avec la liaison avec l’ARN de liaison. Une fois identifiés, ces composés seront cocristallisés avec la protéine N et leur efficacité améliorée en utilisant des méthodes de chimie médicinale (Karine Alvarez) avec l’information structurale 3D.

Notes


[1] au cours de son post-doctorat financé par une subvention de l’ATIP du CNRS
[2] Ferron F, Li Z, Danek EI, Luo D, Wong Y, Coutard B, Lantez V, Charrel R, Canard B, Walz T, Lescar J (2011) PLoS Pathog 7 e1002030
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