CNRS - AIX MARSEILLE UNIV : UMR7257

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Mécanismes moléculaires de l’activation du récepteur Toll de Drosophile

Responsables Alain ROUSSEL

Les études génétiques ont montré que deux voies principales de régulation, les voies Toll et Imd, contrôlent l’expression des gènes peptides antimicrobiens (AMP) via des facteurs de transcription de type NF-κB [Ferrandon et al., 2007]. La voie Toll est essentielle pour lutter contre les infections fongiques et certaines infections bactériennes de type Gram-positive [Lemaitre et al., 1996]. Toll, le membre fondateur de la famille des récepteurs Toll-like (TLR) n’est pas lui-même un récepteur de reconnaissance de motif (PRR). De fait, il est activé par un ligand de la famille des facteurs de croissance des nerfs (NGF), la cytokine Spz. Pour pouvoir se lier au récepteur Toll, Pro-Spz doit être clivé par la protéase "Spz-processing enzyme" (SPE) [Jang et al., 2006], qui est elle-même activée par des cascades protéolytiques en amont. Une de ces cascades est activée en réponse aux infections bactériennes Gram-positives par un complexe formé de PGRP-SA [Michel et al. 2001], PGRP-SD [Bischoff et al., 2004] et GNBP1 [Gobert et al., 2003] et aux infections fongiques par GNBP3 [Gottar et al., 2006]. Depuis 2007, nous étudions les mécanismes moléculaires de la réponse immunitaire chez la Drosophile en étroite collaboration avec le laboratoire RIDI (IBMC, Strasbourg, France). La première étape du projet a été d’installer le système d’expression en cellules S2 de Drosophile pour produire les protéines recombinantes. L’idée était d’utiliser des cellules de Drosophila melanogaster pour produire les protéines du même organisme. Durant les 4 dernières années, plus de 60 constructions ont été clonées dans le vecteur pMT/V5-His (Invitrogen). Une quarantaine d’entre elles ont été exprimées en moyenne ou grande quantité soit pour la cristallisation ou pour des tests fonctionnels. La plupart des protéines étant glycosylées, la cristallisation reste un défi majeur. Néanmoins, nous avons obtenu la structure cristalline de 8 protéines, dont 5 sont directement liées à l’activation de la voie Toll. La combinaison des données structurales et génétiques nous a permis de confirmer et/ou d’affiner les modèles existants et dans certains cas d’en proposer de nouveaux comme le montrent brièvement les exemples suivants.

Reconnaissance des bactéries par PGRP-SD [Leone et al., 2008].

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Il est généralement admis que les bactéries Gram-positives et Gram-négatives activent les voies Toll et Imd, respectivement. Une des principales différences dans leur peptidoglycane (PGN) réside dans la séquence de la partie peptidique. Le troisième acide aminé est généralement une lysine dans les bactéries Gram-positives et un diaminopimélique acide (DAP) chez les Gram-négatives. PGRP-SD est impliqué dans l’activation de la voie Toll. En effet, les mouches mutantes pour le gène de PGRP-SD ont une capacité réduite à résister à l’infection par Staphylococcus pyogenes and Staphylococcus aureus [Bischoff et al., 2004]. Nous avons déterminé la structure cristalline de PGRP-SD à 1,5 Å de résolution. La comparaison avec les structures connues de PGRP suggère une préférence de reconnaissance pour le PGN de type DAP, ce qui a été confirmé par des expériences de co-précipitation. Ce résultat plutôt étonnant a fait apparaître un niveau de complexité inattendu et non décris par les approches génétiques. Le rôle précis d’une protéine de reconnaissance du PGN de type DAP dans l’activation de la voie Toll nécessitera des études supplémentaires.

Détection des infections fongiques [Mishima et al., 2009]

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Les mouches mutantes pour GNBP3 ne répondent plus à l’injection de champignons morts et succombent rapidement aux infections fongiques mais pas bactériennes [Gottar et al., 2006]. Les membres de la famille GNBP/GRP sont des protéines extracellulaires composées d’un petit domaine N-terminal d’environ 100 résidus et d’un domaine C-terminal d’environ 350 résidus. Nous avons montré qu’une protéine recombinante correspondant à la partie N-terminale de GNBP3 se lie aux champignons et aux longues chaînes de β-1,3-glucane mais pas aux petits laminarioligosaccharides. La détermination de la structure cristalline du domaine N-terminal de GNBP3 révèle un repliement de type immunoglobuline dans lequel la site de liaison aux β-1,3-glucanes est masqué par une boucle qui est strictement conservée dans les protéines de reconnaissance des glucanes trouvées chez différents insectes. Des expériences de mutagénèse dirigée ont montré le rôle essentiel de cette boucle dans la discrimination de reconnaissance entre les chaînes courtes et longues de β-glucanes. Le déplacement de la boucle est nécessaire pour la liaison aux longues chaînes de β-glucanes. Nos résultats nous ont permis de proposer un nouveau mécanisme de reconnaissance des β-glucanes.

Transmission du signal par les cascades protéolytiques [Kellenberger et al., 2011]

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La détection des motifs microbiens par les PRR enclenche des cascades protéolytiques conduisant au clivage de Spz et à l’activation du récepteur Toll. Jusqu’à présent, deux sérine protéase à domaine "clip" (clip-SP), SPE [Jang et al., 2006] et Grass [El Chamy et al., 2008], ont été mise en évidence dans ces cascades. Nous avons résolu la structure cristalline de Grass, dans sa forme zymogène, ce qui représente la première structure d’un clip-SP de Drosophile. Grass possède une profonde crevasse active comparable à celle observée chez les protéases de la coagulation ou du complément. Une caractéristique remarquable est la présence d’une boucle additionnelle (boucle 75) dans l’entourage du site actif. Nous avons établi une classification des clip-SP basée sur la présence de la boucle 75 et sur le type de repliement du domaine clip. Suivant cette classification, Gras est une protéase terminale dans la cascade, ce qui n’est pas en accord avec les données génétiques. Par conséquent, nous proposons un nouveau modèle pour l’activation de Toll dans lequel Grass est une protéase terminale qui clive une protéine de régulation nécessaire à l’activité de SPE.

Notes


[Ferrandon et al., 2007] Ferrandon D, Imler JL, Hetru C, Hoffmann JA (2007) Nat Rev Immunol 7 862-74

[Lemaitre et al., 1996] Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, Hoffmann JA (1996) Cell 86 973-83

[Jang et al., 2006] Jang IH, Chosa N, Kim SH, Nam HJ, Lemaitre B, Ochiai M, Kambris Z, Brun S, Hashimoto C, Ashida M, Brey PT, Lee WJ (2006) Dev Cell 10 45-55

[Michel et al. 2001] Michel T, Reichhart JM, Hoffmann JA, Royet J (2001) Nature 414 756-9

[Bischoff et al., 2004] Bischoff V, Vignal C, Boneca IG, Michel T, Hoffmann JA, Royet J (2004) Nat Immunol 5 1175-80

[Gobert et al., 2003] Gobert V, Gottar M, Matskevich AA, Rutschmann S, Royet J, Belvin M, Hoffmann JA, Ferrandon D (2003) Science 302 2126-30

[Gottar et al., 2006] Gottar M, Gobert V, Matskevich AA, Reichhart JM, Wang C, Butt TM, Belvin M, Hoffmann JA, Ferrandon D (2006) Cell 127 1425-37

[Leone et al., 2008] Leone P, Bischoff V, Kellenberger C, Hetru C, Royet J, Roussel A (2008) Mol Immunol 45 2521-30

[Bischoff et al., 2004] Bischoff V, Vignal C, Boneca IG, Michel T, Hoffmann JA, Royet J (2004) Nat Immunol 5 1175-80

[Mishima et al., 2009] Mishima Y, Quintin J, Aimanianda V, Kellenberger C, Coste F, Clavaud C, Hetru C, Hoffmann JA, Latge JP, Ferrandon D, Roussel A (2009) J Biol Chem 284 28687-97

[Kellenberger et al., 2011] Kellenberger C, Leone P, Coquet L, Jouenne T, Reichhart JM, Roussel A (2011) J Biol Chem 286 12300-7

[El Chamy et al., 2008] El Chamy L, Leclerc V, Caldelari I, Reichhart JM (2008) Nat Immunol 9 1165-70
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