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Optimisation de « hits » obtenus par criblage de la polymérase NS5 du virus de la dengue

Personnes impliquées : Dr Karine Alvarez, Dr Karine Barral, Fatiha Benmansour
Plateforme PCML : Dr Cécilia Eydoux, Prof JC Guillemot, Dr Nicolas Masse, Dr Barbara Selisko, Dr Laétitia Sthul-Gourmand

Nous avons réalisé un criblage d’une chimiothèque de 17000 composés sur la polymérase du virus de la dengue. Il s’est déroulé comme suit :
- le criblage primaire sur l’ensemble des composés (concentration de 35 à 100 µM)
- le criblage secondaire sur les composés sélectionnés au premier tour (seuil à 78% d’inhibition)
- la confirmation de l’activité des composés sur des lots de poudre fraiche.
- la caractérisation physico-chimique des composés (RMN, SM, couplage CLHP-SM)
- la détermination de l’IC50 sur la cible.
- l’évaluation de l’activité du composé sur réplicon dengue. Les molécules identifiées, confirmées en poudre et caractérisées sont testées en replicon pour évaluer leur activité et leur cytotoxicité en cellules.
- la recherche de familles de composés et l’évaluation de l’intérêt de développement
- sélection des hits les plus intéressants pour une caractérisation biochimique poussée et la synthèse d’analogues.

Sur 149 composés hits, 96 composés ont été obtenus en poudre fraiche, 55 composés ont été confirmés comme actifs, 44 composés ont été caractérisés, leur structure et leur pureté ont été déterminées, 30 composés ont présentés une IC50 exploitable et nous nous sommes intéressés à 4 d’entre eux pour lesquels nous avons essayer de caractériser les déterminants de l’activité antivirale.

Afin d’optimiser le profil pharmacologique de ces « hits » et d’améliorer leur activité, spécificité, solubilité, toxicité, nous avons engagé un projet de « hit-to-lead optimisation » en interne et en collaboration avec certains chimiothéquaires de la chimiothèque nationale (Pr Marcel HIbert, Dr F. Gueritte, Dr F. Mahuteau, Dr S. Piguel).

Dans l’équipe, nous avons concentré nos efforts une molécule, issue de la chimiothèque de l’institut Curie.

Nous avons dans un premier temps, poussé la caractérisation du hit en terme de spécificité vis à vis d’autres polymérases virales, mode d’action et activité en réplicon. Sur ce motif, notre objectif était d’améliorer les propriétés pharmacologiques et de diminuer la toxicité de la molécule particulièrement élevée en test réplicon, tout en améliorant son activité vis à vis de l’enzyme. 200 molécules ont été synthétisées, 144 ont été testées. Les molécules les plus prometteuses ont été testées sur l’enzyme, dans un test réplicon et envoyées pour test en culture de cellules infectées par plusieurs sérotypes de dengue (DEN-1 à DEN-4) pour celles ne présentant pas de toxicité cellulaire (collaboration Dr Gilles Querat, projet SILVER). A ce jour, nous avons soutenu l’amélioration d’un hit vers une nette diminution de la toxicité cellulaire, tout en conservant une bonne activité sur l’enzyme.

Nous espérons ainsi, développer un savoir-faire et mettre au point des méthodes, qui pourront être appliquées à d’autres molécules, sur d’autres cibles virales. Nous souhaitons aussi accroître nos chimiothèques et aborder le criblage de chimiothèques ciblées.

A terme, nous espérons mettre en place une plate-forme de « synthèse moyen débit » d’analogues intégrée dans un contexte multidisciplinaire dédié aux molécules antivirales. Nous disposons de matériel de synthèse et de purification en parallèle, d’un synthétiseur micro-ondes, ainsi qu’un système HPLC/MS pour l’analyse des composés synthétisés.

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Figure 1
Multi-réacteur BUCHI
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Figure 2
Système de purification en série BIOTAGE
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Figure 3
Synthétiseur micro-ondes BIOTAGE
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Figure 4
système HPLC/MS Thermo-Scientific

Publications

- Masse N, Davidson A, Ferron F, Alvarez K, Jacobs M, Romette JL, Canard B, Guillemot JC (2010) Antiviral Res 86 296-305

Collaborateurs

- Dr Françoise Gueritte, ICSN, Gif-sur-Yvette, France.
- Dr Florence Mahuteau et Dr Sandrine Piguel, Institut Curie Recherche, Orsay, France.
- Pr Marcel Hibert, Laboratoire de Pharmacochimie de la Communication Cellulaire, UMR 7081, Illkirch Cedex, France
- Dr Xavier Morelli, Laboratoire de Bioénergéntique et Ingénierie des protéines (UPR9036), Marseille, France.
- Dr Gilles Querat, Unité des virus émergents, Faculté de Médecine, Marseille, France.

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Faculté de Médecine-Timone,
27, boulevard Jean-Moulin
13385 Marseille cedex 5

Financements

- Projet Européen SILVER. FP7-HEALTH-2010-Drug lead discovery against RNA viruses. Section 3. Contrat CDD Ingénieur d’Etude en chimie de 12 mois dans le cadre du contrat Européen SILVER (Février 2012-).
- Projet ANR-07-BLAN-0285. Dengue D.-D. (2007-2010). 200000 euros sur 3 ans.

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