CNRS - AIX MARSEILLE UNIV : UMR7257

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Production de protéines eucaryotes recombinantes

Responsable Claire DEBARNOT

Introduction

La plateforme de service de production de protéines eucaryotes recombinantes est labellisée par le Groupement d’Intérêt Scientifique « Infrastructures en Biologie Santé et Agronomie” (GIS IBISA). Elle fait aussi partie du projet d’infrastructure nationale FRISBI (French Infrastructure for Integrated Structural Biology) qui regroupe cinq centres d’excellence dans le domaine de la biologie structurale intégrative. Plusieurs dizaines de protéines eucaryotes sont produites chaque année sur la plateforme dans le cadre de projets de recherche portant sur l’analyse de la structure des protéines et des interactions protéine-protéine, protéine-DNA et protéine-ligand organique ou inorganique.

Stratégie

Le personnel responsable de la plateforme et le comité local d’utilisateurs analysent la faisabilité des projets extérieurs présentés, définissent ensuite un système d’expression adéquat (choix des lignées cellulaires, des vecteurs et tags) et déterminent les conditions expérimentales de production les plus appropriées (choix des milieux de culture et des conditions d’expression).

Lorsque les taux d’expression transitoire sont suffisamment élevés, les volumes ou fréquences de production sont adaptés en fonction des besoins.

Lorsque les taux d’expression transitoire sont trop faibles pour les besoins du projet, des lignées clonales (mammifère) ou pseudo-clonales (insecte S2) peuvent être établies en quelques semaines, puis gardées en production ou congelées et stockées pour un usage ultérieur.

Technologie

La plateforme utilise les technologies les plus récentes pour la production de protéines eucaryotes recombinantes solubles ou membranaires. Elle est en lien étroit avec les utilisateurs qui assurent la détection, la purification et la caractérisation des protéines produites.

Production

Production en cellules de mammifères

L’AFMB dispose d’une licence d’exploitation du brevet WO2009/137911 [1] permettant l’utilisation de cellules HEK293-6E (EBNA, Epstein-barr virus antigen-1) et de vecteurs spéciaux contenant l’origine de réplication virale oriP (PYD, pTT). Comparé aux systèmes plus classiques, cette technologie innovante permet d’obtenir de meilleurs rendements de production transitoire de protéines recombinantes.

Les cellules HEK293-GNT1- [2] peuvent être utilisées pour la production transitoire de protéines N-glycosylées. Ces cellules permettent d’obtenir une N-glycosylation plus simple et homogène (Man5GlcNAc2), susceptible de faciliter certaines études structurales.

D’autres lignées cellulaires telles que COS-7 et CHO-K1 peuvent aussi être utilisées si besoin.

Si nécessaire, des lignées stables peuvent être établies en quelques mois dans le système de production tétracycline-inductible T-REx d’Invitrogen (CHO-TREx ou HEK-TREx) [3].

Les productions s’effectuent en flasques de type Multi-Flask, Roller ou Spinner selon les rendements et quantités demandées.

Production en cellules d’insectes

Les productions sont réalisées par transfection de cellules S2 de drosophile à l’aide de vecteurs métallo-inductibles (pMT-DEST48, pMT/BiP/V5-His, Life Technologies) [4]. Des lignées stables polyclonales ou pseudo-clonales peuvent être aussi établies en quelques semaines.

Les productions sont aussi réalisées en cellules Sf9 (Spodoptera frugiperda) après infection par un baculovirus (système Bac-to-Bac, Life Technologies) [5]. Après une première étape de transfection du bacmide recombinant, un stock viral est constitué. Celui-ci est titré et utilisé pour infecter les cellules à la MOI (Multiplicity Of Infection) optimale.

Les productions s’effectuent alors en Multi-Flasks (cellules adhérentes) ou en Spinners (cellules en suspension) selon les rendements et les quantités demandées.

Détection et quantification des protéines produites

Les protéines eucaryotes sécrétées sont quantifiées directement dans le milieu de culture par Dot-blot et à l’aide de l’instrument de détection OctetRed96 (ForteBio). Leur masse est aussi vérifiée par Western blot.

Les protéines eucaryotes membranaires sont quantifiées après une étape de re-solubilisation à l’aide de détergents.

Matériel

-  4 incubateurs à CO2 (Thermo Heracell 240i)
- 3 armoires thermorégulatrices
- 4 PSMII
- 1 microscope à fluorescence (Nikon Eclipse TS100)
- 1 microscope inversé (Olympus CK2)
- 2 centrifugeuses et 1 ultracentrifugeuse (Avanti J-26XP)
- 1 OctetRed96 (ForteBio)
- Appareils pour Dot-blot et Western-blot

Notes


[1] Process, vectors and engineered cell lines for enhanced large-scale transfection.
Durocher Y, Loignon M
National Research Council of Canada
WO2009/137911
[2] A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.
Ariscecu AR et al.
Acta Cryst (2006) D62, 1243–1250
[3] Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.
Yao F et al.
Hum Gene Ther (1998) 9, 1939-1950
[4] Expression of cellulose synthase-like (Csl) genes in insect cells reveals that CslA family members encode mannan synthases.
Liepman AH et al
Proc Natl Acad Sci U S A (2005) 102 :2221-2226
[5] Rapid generation of recombinant baculoviruses and expression of foreign genes using the Bac-To- Bac® baculovirus expression system.
Anderson D et al
Focus (1996) 17, 53-58
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