Article
Le « refolding » in vitro des protéines est une méthode qui permet de produire des protéines recombinantes qui sont exprimées dans E. coli sous forme de corps d’inclusion. Pour cela, un test de refolding composé de 96 tampons de renaturation a été développé à l’AFMB et validé avec 24 protéines, dont 70% étant soluble dans au moins un tampon [1]. Nous avons analysé plus en détail les données expérimentales de cette étude afin de vérifier si le processus de refolding pouvait suivre des règles générales. Nous avons notamment observé que les protéines avec un point isoélectrique (pI) bas sont renaturées dans des tampons majoritairement alcalins, et inversement. En outre, le nombre de tampons de renaturation dans lesquels une protéine reste soluble augmente avec la différence entre son pI et le pH moyen des tampons dans lesquels elle est renaturée. Une analyse des tendances des autres variables (force ionique, détergents, etc) a également été réalisée. Sur la base de cette analyse, nous avons conçu un tampon unique de repliement pour les protéines acides et un tampon unique de repliement pour des protéines alcalines [2].
- Protomère de NP
- Représentation d’un protomère de NP du virus responsable de la fièvre de la Vallée du Rift, obtenu à partir de protéine produite en conditions non dénaturantes (code PDB 3OV9, Tableau A.) ou après refolding in vitro (code PDB 3LYF, Tableau B.). La principale différence de conformation correspond au positionnement de deux hélices alpha colorées en rouge.
Parmi l’ensemble des protéines utilisées pour la confirmation de notre analyse de tendance, nous avons sélectionné trois nucléoprotéines (NPS) de Phlébovirus. Sous forme recombinante, les NPs ont généralement tendance à former des oligomères hétérogènes, ce qui empêche la caractérisation du processus d’encapsidation par des études cristallographiques. Pour contourner ce problème, nous avons mis en place un protocole standard dans lequel les productions des protéines en conditions non-dénaturantes ou dénaturantes peuvent être étudiées et comparées. Deux des trois NPs de Phlébovirus ont été produites et purifiées en quantité et qualité suffisantes pour initier les études de cristallogenèse. Les formes trimères de ces deux NPs (du virus responsable de la fièvre de la vallée du Rift et du virus Toscana) ont permis d’obtenir des cristaux. Etonnamment, la NP du virus responsable de la fièvre de la vallée du Rift a été purifiée sous forme trimérique dans des conditions natives alors que la version renaturée a été obtenue sous forme de dimère. Différemment, la NP du virus Toscana a été purifiée sous forme de trimère à la fois en conditions dénaturantes et non dénaturantes, avec toutefois des rendements de production plus élevés après renaturation.
La structure de la NP du virus responsable de la fièvre de la vallée du Rift a été obtenue à partir d’une protéine renaturée durant la réalisation de cette étude, mais elle n’a pas permis de faire la lumière sur le mécanisme d’encapsidation [3]. L’information manquante sur ce mécanisme a été apportée par la structure cristallographique obtenue à partir de la forme trimérique [4].
Ces études de cas ont mis en évidence les avantages et les limites de l’utilisation de la renaturation des corps d’inclusion pour les études cristallographiques [5], laissant ainsi la question "To fold or to refold ?" ouverte.
Structure 3OV9
Structure de la nucléotprotéine du virus de la Vallée du Rift. PDB Code 3OV9
Structure 3LYF
Structure de la protéine de la nucléocapside du virus de la Vallée du Rift. PDB Code 3LYF
