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Trouver de nouveaux analogues de nucléotides pour contourner la résistance de la RT du HIV aux drogues de type nucléosi(ti)dique.

Responsable Karine ALVAREZ

Introduction

La transcriptase inverse (TI ou RT) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est essentielle dans le processus de réplication virale et représente donc une cible évidente privilégiée des produits antiviraux. Les inhibiteurs nucléosidiques sont un élément essentiel du traitement antirétroviral actuel. Malheureusement, les traitements utilisant des analogues nucléosidiques perdent de leur efficacité au cours du temps, alors qu’émergent simultanément des virus résistants. L’abondance de souches du VIH-1 résistantes à plusieurs molécules antivirales rend la situation actuelle très préoccupante .

Notre but est de concevoir une nouvelle génération d’inhibiteurs nucléotidiques qui soient plus efficaces que les antirétroviraux actuellement utilisés en thérapie pour bloquer la RT du VIH-1 de façon irréversible.

Notre groupe s’interesse de très près à ces problèmes de résistance. Leur compréhension est fondamentale pour nous guider vers la conception de nouveaux médicaments plus efficaces.

Le Tenofovir sous forme de prodrogue (VIREAD®, Gilead) a été approuvé par la FDA en octobre 2001 en monothérapie contre le VIH-1 a obtenu l’AMM en Europe en février 2002. C’ est un médicament majeur dans la lutte anti-VIH. Ce composé est un analogue de nucléotide de type phosphonate acyclique. Il a révolutionné le traitement contre le VIH-1 et a permis de véritablement améliorer les prises (fréquence, dosage) du médicament. Toutefois, comme pour tous les autres nucléosides utilisés en thérapie, les virus (en particulier, ceux déjà résistants à l’AZT) répondent mal au traitement, ou bien deviennent résistants à ce composé (mutation K65R).

les boranophosphonates

Personnes impliquées : Dr Karine Alvarez, Dr Karine Barral, Dr Céline De Michelis, Dr Antoine Frangeul.

En 2002, nous avons développé des analogues nucléotidiques totalement inédits : les α-boranophosphonates, conçus afin d’obtenir une synergie des propriétés biochimiques et enzymatiques intéressantes et reconnues des dérivés ‘’borano’’ d’un côté et des dérivés ‘’phosphonates’’ de l’autre. Les premiers α-boranophosphonates dérivés de l’AZT, du d4T, du PMEA et PMPA ont été synthétisés selon une méthode originale.

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Figure 1
Structure des molécules cibles boranophosphonates

Les composés ont été évalués en culture de cellules infectées par différents virus, et aucun n’a montré d’activité, ni de toxicité. Afin d’expliquer l’inactivité de ces analogues boranophosphonate en culture de cellules infectées par le VIH-1 et 2 et d’autres virus d’intérêt, nous avons tenté de répondre aux questions suivantes :
- ces composés sont-ils stables dans les fluides biologiques ?
- sont-ils phosphorylés par les kinases cellulaires humaines hAK1 et hAK2 ?
- sont-ils de bons substrats pour la transcriptase inverse du VIH-1 ?

A la question de leur stabilité, nous avons pu répondre que ces composés se dégradent assez rapidement en milieu de culture complet et en extraits de cellules pour certains d’entre eux, avec des temps de demi-vie de moins de 3h. La dégradation des analogues acycliques BH3-PMEA et BH3-PMPA, ainsi que du boranophosphonate de l’AZT, est due à une réduction de liaison P-B en liaison P-H, conduisant à la formation des analogues H-phosphinates correspondants, particulièrement stables dans les fluides biologiques, mais inactifs aussi en cultures de cellules infectées. La voie de décomposition du boranophosphonate du d4T suit un mécanisme de rupture de la liaison glycosidique avec libération de la nucléobase. La suite des études a été conduite uniquement sur les analogues acycliques BH3-PMEA et BH3-PMPA. Pour lesquels, nous avons pu montrer qu’ils étaient très mal phosphorylés par les kinases humaines hAK1 et hAK2, avec des efficacités catalytiques, inferieures de plus de 105 fois à celles des analogues naturels correspondants.

Par contre, des études en cinétique pré-stationnaire d’incorporation des formes triphosphates BH3-PMEADP et BH3-PMPADP, que nous avons synthétisées, nous ont permis de mettre en évidence que ces composés contournent ou réduisent la résistance du mutant K65R de la RT, comparativement aux analogues non borano PMEADP et PMPADP. En d’autres termes, l’effet du groupement borano, décrit préalablement sur des analogues de nucléotides boranophosphates, se retrouve sur des analogues boranophosphonates, en particulier avec un effet d’amélioration de la vitesse d’incorporation de ces composés.

Par rapport aux objectifs, que nous nous étions fixés, au démarrage de ce projet, nous avons atteint la plupart d’entre eux, tant au point de vue de la synthèse et l’évaluation biologique que de la caractérisation biochimique mais il n’en reste pas moins que les boranophosphonates ne sont pas des composés applicables en chimiothérapie contre le VIH.

Publications

  • Barral K, Priet S, De Michelis C, Sire J, Neyts J, Balzarini J, Canard B, Alvarez K (2010) Eur J Med Chem 45 849-56
  • Topalis D, Alvarez K, Barral, Munier-Lehmann H, Schneider B, V�ron M, Guerreiro C, Mulard L, El-Amri C, Canard BDeville-Bonne D (2007) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27 319-31
  • Frangeul A, Busseta C, Deval J, Barral K,Selmi B, Boretto J, Alvarez K, Canard B (2008) Antivir Ther 13 (1) 115-24
  • Frangeul A, Barral K, Alvarez K, Canard B (2007) Antimicrob Agents Chemother 51 3162-7
  • Barral K, Priet S, Sire J, Neyts J, Balzarini J, Canard B, Alvarez K (2006) J Med Chem 49 7799-7806
  • Deval J, Alvarez K, Selmi B, Bermond M, Boretto J, Guerreiro C, Mulard L, Canard B (2005) J Biol Chem 280 3838-46
  • Alvarez K, Deval J, Selmi B, Barral K, Boretto J, Guerreiro C, Mulard L, Sarfati R, Canard B (2005) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 24 419-21

Collaborateurs

- Drs Johan Neyts / Jan Balzarini, Rega Institute for medical research , Université catholique de Leuven , Belgique.
- Dr Dominique Deville-Bonne.
- Dr Joséphine Sire.
- Pr Fabien Zoulim, Faculté de médecine RTH Laennec, Lyon.

Fundings

- Bourse post-doctorale SIDACTION pour le Dr C. De Michelis (janvier 2003 - janvier 2005)
- Bourse post-doctorale ANRS pour le Dr K. Barral (janvier 2004 - janvier 2006)
- ESC-Sidaction. Projet intitulé « conception de nouveaux inhibiteurs nucléotidiques dirigés contre la RT du VIH-1 : contourner la résistance aux drogues de type nucléosidique ». 50000 euros sur 2 ans.

Thiophosphonates : Adethiovir and Tenothiovir.

Personnes impliquées : Dr Karine Alvarez, Dr Karine Barral, Dr Antoine Frangeul, Nadine Payrot, Dr Stéphane Priet, Loic Roux, Clément Weck.

Nous avons par la suite découvert des analogues thiophosphonates dérivés de l’Adéfovir (PMEA) et Ténofovir (PMPA), actifs contre le VIH-1, VIH-2 et le VHB en culture de cellules infectées. Ces composés ont été baptisés Adethiovir ou S-PMEA et Tenothiovir ou S-PMPA.

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Figure 2
Structure des molécules cibles thiophosphonates

Ces composés sont couverts par une demande de brevet de notre part (B. Canard, K. Alvarez, K. Barral, J.L. Romette, J. Neyts, J. Balzarini, WO/2008/056264, (2008)).

Les composés ont montré une excellente activité antivirale, similaire à celle de l’Adefovir et du Tenofovir, et n’ont pas montré de cytotoxicité. Leur pharmacologie préliminaire est favorable : ils sont stables plus de 24h dans des milieux mimant les fluides biologiques (milieu de culture et extraits de cellules). Nous avons synthétisé les formes diphosphates correspondantes S-PMEApp et S-PMPApp. Des études en cinétique pré-stationnaire d’incorporation des composés thiophosphonate diphosphates nous ont permis de mettre en évidence que ces composés sont substrats et inhibiteurs de la RT du VIH-1 sauvage et mutante K65R. Ils sont incorporés et terminateurs de chaine. De plus, le S-PMPApp présente même une valeur ajoutée certaine par rapport au PMPApp puisqu’il élimine la résistance du mutant K65R de la RT. Ainsi, l’IC50 s’avère être semblable voire meilleur, l’affinité de ces composés est améliorée et la vitesse initiale d’excision de ces composés par les RT AZT-resistantes est diminué d’un facteur 7 à 18. Cela est du au fait que nos composés bloquent la RT dans une conformation inerte. Ces dérivés thiophosphonates présentent donc une valeur ajoutée non négligeable par rapport à l’Adefovir et le Tenofovir, notamment pour lutter contre les mutants de résistance sélectionnés par les thérapies actuelles.

Nous avons synthétisé des formes vectorisables de l’Adethiovir et du Tenothiovir. Elles ont présenté une activité antivirale améliorée, ce qui valide la stratégie prodrogue appliquée à nos composés. Les dérivés thiophosphonates Adethiovir et Tenothiovir ont déjà passé avec succès quelques étapes importantes de leur caractérisation, les rapprochant d’une évaluation préclinique. Ces résultats préliminaires font de ces molécules des candidats médicaments particulièrement prometteurs. Ces composés pourraient constituer des futurs médicaments présentant les mêmes avantages que le Ténofovir ou l’Adefofir, mais avec une meilleure capacité à cibler des virus résistants et probablement un spectre de résistance différent, diversifiant ainsi le panel de choix thérapeutique du praticien.

Publications

- Barral K, Weck C, Payrot N, Roux L, Durafour C, Zoulim F, Neyts J, Balzarini J, Canard B, Priet S, Alvarez K (2011) Eur J Med Chem 46 4281-8

- Patent B. Canard, K. Alvarez, K. Barral, J.L. Romette, J. Neyts, J. Balzarini, WO/2008/056264, (2008)

Collaborateurs

- Drs Johan Neyts / Jan Balzarini, Rega Institute for medical research , Université catholique de Leuven , Belgique.
- Dr Jean-luc Galzi, IFR 85 Gilbert Laustriat, Biomolécules et innovations thérapeutiques, Plate-forme « Preclinical Drug Technology », Faculté de Pharmacie et Ecole Supérieure de Biotechnologie, ILLKIRCH Cedex
- Pr Fabien Zoulim, INSERM, U871, Université de Lyon, Hospices Civils de Lyon, 69003.
- Pr Vincent Calvez. Service de Virologie Hopital Pitié-Salpêtrière 83 Bd de l’hôpital 75013 Paris.

Financement

- Bourse post-doctorale ANRS (2 ans), 2010–2012, pour le Dr Stéphane Priet. « Tenothiovir et adethiovir : nouveaux analogues phosphonates acycliques pour cibler les VIH-1 resistants ».
- Financement ANRS (2 ans), 150000 euros (septembre 2007 – septembre 2009). « Tenothiovir et adethiovir : nouveaux analogues phosphonates acycliques pour cibler les VIH-1 resistants ». Financement d’une prestation de service auprès de la société SPI-BIO pour caractériser les thiophosphonates dans un contexte cellulaire (virus sauvage et mutants cliniquement relevants).
- Complément de Demande d’Aide aux Equipes (SIDACTION), obtenue en mai 2007. « Découverte de nucléotides thiophosphonates actifs contre le VIH. Evaluation sur virus résistants » N/Ref : 10016-02-00/AO17-2. Salaire Ingenieur d’Etude, 1 an, Nadine Payrot (juin 2007 – mai 2008).
- Demande d’Aide aux Equipes (SIDACTION), obtenue en juillet 2006. « Découverte de nucléotides thiophosphonates actifs contre le VIH. Evaluation sur virus résistants » N/Ref : 10016-02-00/AO17-2. 25000 euros sur 1 an (Nov 2006 – Nov 2007)

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