Plateforme de Criblage Marseille-Luminy

La plateforme de criblage Marseille – Luminy (PCML) est impliquée dans la recherché d’antiviraux et est intégrée au sein de la plateforme AD2P (Antiviral Drug Design Platform). Ce réseau collaboratif est en place depuis 2005 et se compose de la plateforme de criblage Marseille-Luminy (PCML-JC Guillemot), de la plateforme de criblage viral Marseille-Timone (PCVMT-G.Querat) et de la plateforme Interactions, Dynamiques et Drug design (INT-3D-X. Morelli). (Pour plus d’informations, voir : www. ad2p….)

Suite : Activités de PCML

PCML est impliquée dans de nombreux domaines de la recherche antivirale et du drug design :

Création et/ou gestion de chimiothèques

No stocks regroupent près de 60,000 molécules d’origine diverses :

• La chimiothèque commerciale Prestwick (880)
• La chimiothèque National cancer institute diversity (NCI) (2000)
• La chimiothèque Chembridge^TM "Diversity Set" (30,000)
• La chimiothèque nationale” (21,000) divisée en :
  • Chimiothèque nationale de Strasbourg (5000)
  • Chimiothèque de l’institut Curie (8000)
  • Chimiothèques de Gif-sur-Yvette ICSN (3000) et d’extraits naturels (5000)
  • La chimiothèque nationale de Caen (400)
• La chimiothèque Active sightTM fragment based library (360)

Il est à noter que ce stock est régulièrement augmenté par l’ajout des composés développés par notre équipe de chimistes (400) et par les molécules issues de nos collaborations extérieures (2000).

Fig 1 : plaques mères d’une chimiothèque

Les composés sont stockés dans des plaques 96 puits scellées et dites “plaques mères”, en 100% DMSO et à -20°C. Les plaques dites “filles” ou les dupliqua de plaques mères sont générées automatiquement grâce à un Biomek NX (Beckman), robot pipetteur équipé d’une tête 96 puits (Fig 2).

Fig 2 : robot Biomek NX

Criblage enzymatique

Les composés sont évalués en testant leur potentiel inhibiteur sur les enzymes virales purifiées. Celles ci sont des :

• polymérases à ARN ARN-dépendantes (Flaviviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Nidovirus)
• protéases (Flaviviridae, Togaviridae, Alphavirus)
• NTPases (Flaviviridae, Picornaviridae, Calicivirdae)

Nous disposons également, mais non adaptée à du criblage haut débit, de :

• mRNA cap Methyl Transférases (Flavivirus, Coronavirus)
• Endoribonucléases (Nidovirus)
• RNA Triphosphatases (Flavivirus)
• RNA or NTP binding activités (Flaviviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Nidovirus)
• Poly(ADP)ribose binding activités (Nidovirales, Alphavirus)
• Hélicases (Flaviviridae, Caliciviridae)

Les essais radioactifs sont effectués dans un laboratoire dédié, de type P2, permettant la manipulation de radioéléments de type ³H et ³²P (Fig.3).

Fig 3 : Laboratoire de type P2 d’expérimentation en radioactivité

La détection et la quantification du signal radioactif sont effectuées par un compteur à scintillation Wallac MicroBeta® Trilux (Perkin-Elmer) (Fig.4) ou un phosphoimager Fujifilm (Life science) (Fig.5).

Afin d’être adapté à du criblage haut débit, les essais ont été robotisés à l’aide de robots Biomek 3000 (disposant d’une tête monocanal et d’une tête 8 canaux) et Biomek NX (tête 96-puits, également adaptée pour des criblages en 384 puits) (Vidéo 1 and 2).

Comment s’effectue le criblage d’une chimiothèque ?
Sur les essais disponibles à l’heure actuelle, un premier tour de criblage est mis en œuvre à 50 µM (ou 50 µg/ml dans le cas d’extraits naturels) (1 puit/composé, 80 composés/plaque), ce qui nous permet d’analyser jusqu’à 240 molécules par jour en triplicat.
La préparation des plaques et l’analyse finale des résultats nécessite généralement 2 jours de plus.
Le « cherry-picking » automatisé des molécules sélectionnées et un deuxième tour de criblage à 10 µM (ou 10 µg/ml) en triplicat est également fait en quelques jours.

Les tests de confirmation sont généralement réalisés à partir des composés en poudre (quand ils sont disponibles) fraîchement resolubilisés et sont suivis par la détermination des IC50 (concentration inhibant 50% de l’activité).
En fonction des résultats du criblage, la caractérisation biochimique des « hits » est poursuivie.

Dans le cas de nouvelles enzymes (source externe), une phase de faisabilité est nécessaire et est suivie par le développement et l’automatisation d’un test. Le savoir faire acquis lors des tests précédents est un atout précieux dans le succès de ces développements technologiques.

Dans l’hypothèse ou l’enzyme n’est pas disponible, il est possible d’en faire la demande auprès de la plateforme de génomique structurale de l’AFMB (expression et purification de protéine à haut-débit) (mettre lien vers cette plateforme).

Services de synthèse et optimisation de composés « hits »

L’une de nos forces est la présence d’une équipe de chimistes au sein de l’AFMB, dirigée par le Dr K.Alvarez, impliquée dans l’élaboration et le suivi des différents projets de PCML. Les chimistes s’investissent dans l’analyse des résultats, la classification des « hits » et, à partir de là, sélectionnent des familles de molécules pour définir des analogues à synthétiser, dans le long processus d’optimisation « hit-to-lead ».
Afin d’améliorer le profil pharmacologique des « hits » et/ou d’améliorer l’activité, spécificité, solubilité, toxicité, nous réalisons la synthèse de plusieurs séries d’analogues.
Pour aborder la synthèse chimique des familles de composés « améliorés », nous avons choisi des techniques modernes et innovantes à base de synthèse parallèle.
Nous nous sommes dotés d’appareils de synthèse (Multi-réacteur Buchi Syncore, Micro-ondes Initiator Biotage) et de purification en parallèle (Biotage SP4).
L’ensemble de ces outils nous permet de synthétiser des chimiothèques ciblées.
Le dispositif de synthèse et de purification est complété par des outils d’analyse des composés générés grâce à une HPLC HPLC Chromatographie haute performance en phase liquide (Waters) et une HPLC HPLC Chromatographie haute performance en phase liquide /MS (Thermofisher). Ces deux appareillages permettent aussi de vérifier/surveiller la stabilité chimique et/ou enzymatique des molécules testées sur la plateforme de criblage.

Le criblage cellulaire

Nos activités sont basées non seulement sur le criblage enzymatique mais également sur le criblage cellulaire afin d’évaluer la cytotoxicité et le potentiel inhibiteur des composés contre les virus réplicons.

• L’évaluation de la cytotoxicité des composés peut être définie à l’aide d’un test de viabilité sur deux types cellulaires (cellules BHK-21 et COS-7) et leur TC50 est déterminée (concentration pour laquelle 50% des cellules meurent).
• Identification d’inhibiteur contre le virus réplicon basée sur l’établissement de lignées cellulaires réplicon-EGFP. Sur le même principe que le criblage enzymatique, les molécules sont testées pour évaluer leurs capacités à inhiber le système réplicon développé par PCML (Fig 6.)

Fig 9 : Criblage des composés sur le modèle cellulaire réplicon

Nous avons établi des lignées cellulaires stables dans lesquelles les protéines non structurales sont capables de se répliquer indépendamment du virus et qui expriment la protéine de fusion PAC-GFP (puromycine N acétyl transférase-green fluorescent protein). Les niveaux de fluorescence sont corrélés avec l’activité du réplicon et sont reliés au potentiel inhibiteur des composés.

L’ensemble de ces essais est basé sur la fluorescence, utilisant comme détecteur un fluorimètre Tecan Safire² (Fig 7).

Fig 10 : Fluorimètre Tecan Safire²

LIMS et gestion des données

Dès la mise en place de la plateforme, notre objectif a été d’assurer un système de gestion et traçabilité des expériences effectuées par la plateforme. Dans ce but, nous avons co-développé un LIMS (gestion/base de données, Laboratory Information Management System), en partenariat avec la société Modul-Bio (www.modul-bio.com).
L’activité principale de Modul-Bio est de développer des outils de suivi, pilotage et gestion de LIMS. Ce partenariat a conduit à la création d’un LIMS adapté au criblage et à nos besoins spécifiques, qui a rencontré par la suite un succès commercial qui est exploité par d’autres laboratoires académiques ou entreprises.

Le LIMS propose des solutions de gestion des résultats de criblages à travers la gestion unique de plusieurs bases de données : la chimiothèque de composés (plaques, visualisation, tracabilité, recherche de motifs, etc…), la chimiothèque de virus (souches, phylogénie, etc…), les campagnes de criblages (traçabilité, recherche de résultats, qualités des campagnes).
L’intégration de nouveaux outils expérimentaux au LIMS est possible grâce à un logiciel modulable, une évolution des programmes et une personnalisation des automates. Le LIMS a ainsi évolué et est un lien entre les trois plateforme formant l’AD2P

Fig 11 : Base de données LISM de PCML

En pratique, chaque composé de chaque chimiothèque est référencé dans la base de données et est relié à ses caractéristiques chimiques et biologiques. Chaque plaque possède un code barre et l’ensemble des plaques et des expériences est enregistré dans la base de données (Fig 11).

Identification d’inhibiteurs dirigés contre les interactions protéine-protéines in situ et in vitro

Nous avons développé une technique de criblage pour déterminer le potentiel inhibiteur de composés chimiques contre les interactions des protéines d’intérêt.

Fig.12 : Stratégie de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) pour le criblage de composés chimiques.

Nous utilisons la technologie BRET pour cibler les protéines partenaires et identifier les inhibiteurs spécifiques.

L’intéraction protéine-protéine, à l’aide d’un test dit BRET, peut être applicable aux cellules vivantes et aux lysats cellulaires. La technologie BRET est basée sur le transfert d’énergie (fluorescence/luminescence) qui est détecté par un PolarStar Omega (BMG Labtech) (Fig 13).

Fig 13 : PolarStar Omega (BMG Labtech)

(Mesure de fluorescence et luminescence)

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Nos offres sont pensées pour être aussi modulables que possible, permettant à nos chercheurs de choisir plusieurs options. PCML propose son expérience et son savoir faire sur :

• Le criblage d’inhibiteurs des enzymes virales
  • Criblage sur des enzymes virales et caractérisation biochimique
  • Criblage d’inhibiteurs d’interactions protéines-protéines ou protéine-ligand
  • Détermination de cytotoxicités et criblage cellulaire de composés
  • Miniaturisation d’essais biochimiques en criblage haut-débit
• Fourniture de chimiothèques
  • Issues de nos chimiothèques disponibles à l’AFMB
  • Issues de chimiothèques orientées
  • Synthèse de chimiothèque orientées et études SAR
• Le développement de nouvelles technologies
  • BRET in situ
  • Essais en fluorescence
  • Développement de tests type HTRF…

Il est également possible de cribler l’activité inhibitrice de nos composés sur une enzyme d’intérêt, ou encore de cribler des composés extérieurs sur nos enzymes.

Toute opportunité de collaborations sera sérieusement prise en compte. Merci d’envoyer vos propositions au directeur de la plateforme : Pr Jean-Claude Guillemot (jean-claude.guillemot afmb.univ-mrs.fr)

Retour : Activités de PCML | Suite : L’Equipe

Directeur de la plateforme
 Pr Jean-Claude GUILLEMOT

Comité scientifique
 Pr Jean-Claude GUILLEMOT
 Dr Karine ALVAREZ
 Dr Bruno CANARD

Equipe opérationnelle
 Dr Barbara SELISKO
 Dr Cécilia EYDOUX
 Dr Laetitia STUHL-GOURMAND
 Dr Karine BARRAL

Karine ALVAREZ

Karine BARRAL

Bruno CANARD

Cécilia EYDOUX

Jean-Claude GUILLEMOT

Barbara SELISKO

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Liste des collaborations et prestations de services achevées et en cours

• 2011 Prestation de service pour l’institut REGA Louvain/Belgique (projet SILVER)
  • Fourniture d’une chimiothèque (ChemBridge)
• 2011 Prestation de service pour l’AFMB équipe « Désordre structural et reconnaissance moléculaire ».
  • Développement et miniaturisation d’un test HTRF
• 2011 Prestation de service pour l’institut REGA Louvain/Belgique
  • Détermination des IC₅₀ d’inhibiteurs potentiels sur la polymérase du virus de la Dengue (Flaviviridae)
• 2011 Collaboration avec l’école de pharmacie de Bombay, Mumbai
  • Criblage de molécules potentiellement inhibitrices issues de l’école de pharmacie de Bombay sur quatre méthyltransférase « maison » (Coronaviridae, Flaviviridae, human)
• 2010 à aujourd’hui Collaborations au sein du FP7 projet européen SILVER (Small-molecule Inhibitor Leads Versus emerging and neglected RNA viruses)
  • Caractérisation de plusieurs molécules inhibitrices sur les polymérases de Picornaviridae (spécificité, valeurs de Ki, type d’inhibition)
  • Caractérisation de molécules inhibitrices sur la polymérase du virus de la Dengue
• 2007 à 2011 Collaborations avec l’Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN), la faculté de Pharmacie UMR 8076 Université Paris-Sud et le LIVE-UNCEA université de Nouvelle Calédonie
  • Criblage d’extraits naturels et de fractions (fractionnement bioguidé)
  • Découverte d’inhibiteurs de la polymérase du virus de la Dengue
  • Caractérisation biochimique d’inhibiteurs de la polymérase du virus de la Dengue et spécificité sur d’autres polymérases virales
  • Détermination de la cytotoxicité et du potentiel inhibiteurs des molécules sur système réplicon
• 2007 à 2010 Collaboration avec l’Institut Curie (Paris), l’institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN) et l’école de Biotechnologie et de Pharmacie Strasbourg dans le cadre de l’ARN Dengue
  • Criblage de la chimiothèque nationale
  • Découverte d’inhibiteurs de la polymérase du virus de la Dengue
  • Caractérisation biochimique d’inhibiteurs de la polymérase du virus de la Dengue et spécificité sur d’autres polymérases virales
  • Détermination de la cytotoxicité et du potentiel inhibiteurs des molécules sur système réplicon
• 2006 à 2009 Collaborations dans le cadre du FP6 projet européen VIZIER (Comparative Structural genomics of Viral Enzymes involved in Replication)
  • Découverte d’un inhibiteur de nucléoside-2’O méthyl transférase du virus de la Dengue
  • Criblage de molécules sur la polymérase B3 du virus Coxsackie (Picornaviridae)
• 2008 Collaboration avec le centre de recherche des maladies infectieuses, école de chimie et biosciences moléculaires, Université de Queensland
  • Test de l’effet inhibiteur sur l’activité polymérase d’anticorps anti-NS5 du virus West-Nile
• 2008 Prestation de service pour la société Vivalis
  • Criblage de molécules d’intérêt et détermination d’IC50 sur la polymérase du virus de la Dengue.

Retour : Membres de l’équipe | Suite : Publications

• Alkylated Flavanones from the Bark of Cryptocarya chartacea As Dengue Virus NS5 Polymerase Inhibitors. (2011)

  Allard PM, Dau ET, Eydoux C, Guillemot JC, Dumontet V, Poullain C, Canard B, Gueritte F, Litaudon M

  J Nat Prod 74 : 2446-53

• Picornavirus non-structural proteins as targets for new anti-virals with broad activity. (2011)

  Norder H, De Palma AM, Selisko B, Costenaro L, Papageorgiou N, Arnan C, Coutard B, Lantez V, De Lamballerie X, Baronti C, Sola M, Tan J, Neyts J, Canard B, Coll M, Gorbalenya AE, Hilgenfeld R

  Antiviral Res 89(3) : 204-218

• Dengue virus replicons: production of an interserotypic chimera and cell lines from different species, and establishment of a cell-based fluorescent assay to screen inhibitors, validated by the evaluation of ribavirin's activity. (2010)

  Masse N, Davidson A, Ferron F, Alvarez K, Jacobs M, Romette JL, Canard B, Guillemot JC

  Antiviral Res 86 : 296-305

• Biochemical characterization of the (nucleoside-2\'O)-methyltransferase activity of dengue virus protein NS5 using purified capped RNA oligonucleotides 7MeGpppACn and GpppACn. (2010)

  Selisko B, Peyrane FF, Canard B, Alvarez K, Decroly E

  J Gen Virol 91 : 112-21

• Identification of allosteric inhibitors blocking the Hepatitis C Virus polymerase NS5B in the RNA synthesis initiation step. (2009)

  Betzi S, Eydoux C, Bussetta C, Blemont M, Leyssen P, Debarnot C, Ben-Rahou M, Haiech J, Hibert M, Gueritte F, Grierson DS, Romette JL, Guillemot JC, Neyts J, Alvarez K, Morelli X, Dutartre H, Canard B

  Antiviral Res 84(1) : 48-59

• Monoclonal antibodies to the West Nile virus NS5 protein map to linear and conformational epitopes in the methyl transferase and RNA-dependant RNA polymerase domains. (2009)

  Hall RA, Tan SE, Selisko B, Slade R, Hobson-Peters J, Canard B, Hughes M, Leung JY, Balmori Melian E, Hall-Mendelin S, Pham KB, Clark DC, Prow NA, Khromykh AA

  J Gen Virol 90 : 2912-2922

• Flaviviral methyltransferase/RNA interaction: structural basis for enzyme inhibition. (2009)

  Milani M, Mastrangelo E, Bollati M, Selisko B, Decroly E, Bouvet M, Canard B, Bolognesi M

  Antiviral Res 83 : 28-34

• The flavivirus polymerase as a target for drug discovery. (2008)

  Malet H, Masse N, Selisko B, Romette JL, Alvarez K, Guillemot JC, Tolou H, Yap TL, Vasudevan S, Lescar J, Canard B

  Antiviral Res 80 : 23-35

• Comparative mechanistic studies of de novo RNA synthesis by flavivirus RNA-dependent RNA polymerases. (2006)

  Selisko B, Dutartre H, Guillemot JC, Debarnot C, Benarroch D, Khromykh A, Despres P, Egloff MP, Canard B

  Virology 351 : 145-58